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染色步驟
病理制片技術(shù)——常規(guī)染色
蘇木精(hematoxylin)和伊(eosin)染色方法,簡(jiǎn)稱HE染色方法,是生物學(xué)、細(xì)胞學(xué)與組織學(xué)最廣泛應(yīng)用的染色方法。在病理科稱為常規(guī)染色 方法。病理學(xué)的診斷都是以HE方法為基礎(chǔ)的。染色的目的是把組織切片或細(xì)胞涂片等浸入染料及其他染色劑配成的染色液中,經(jīng)過適當(dāng)?shù)臅r(shí)間和處理,使組織或細(xì) 胞及其他成分染上不同深淺的顏色,產(chǎn)生不同的折射率,從而便于光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察和研究。
進(jìn)行染色前進(jìn)行染色液的配制,應(yīng)根據(jù)工作量的多少配制相應(yīng)量的染液,同時(shí)應(yīng)注意溶液種類的選擇、溶液濃度、pH值等,另外也應(yīng)注意配方的合理選擇。在實(shí)際工作中,應(yīng)做到以下幾點(diǎn)。
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(1)保持染液的清潔,應(yīng)經(jīng)常過濾或更換。
(2)染色時(shí)間應(yīng)根據(jù)組織的種類、染液的新舊及特殊要求而決定。
(3)染色環(huán)境溫度對(duì)染色效果也有著密切的影響,故染色時(shí)間必須依據(jù)不同條件靈活掌握。
(4)脫蠟干凈與否對(duì)染色效果有著重要影響,烤片溫度、脫蠟二甲苯的溫度、二甲苯的新舊和二甲苯脫蠟的時(shí)間長(zhǎng)短都與染色有著密切關(guān)聯(lián)。
(5)標(biāo)本脫水的好壞及固定的充足與否對(duì)染色效果影響極大。
(6)切片染色后,經(jīng)梯度乙醇脫水,若每步的時(shí)間不足易造成切片發(fā)霧、模糊不清,影響診斷。
在染色過程中,既要按常規(guī)方法步驟進(jìn)行操作,也應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況、個(gè)人經(jīng)驗(yàn)靈活運(yùn)用,不斷總結(jié),才能熟練掌握并提高實(shí)際工作能力與效率。
一、人工染色
人工染色已使用近百年,至今還在使用,既古老又實(shí)用。人工染色的設(shè)置因地區(qū)的差異設(shè)置也不同,但大多數(shù)的地方基本一樣。
1.石蠟切片HE人工染色程序(見表8.1)。
1 | 75℃恒溫烤箱烤片20 min |
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2 | 二甲苯I | 2~5 min |
3 | 二甲苯Ⅱ | 2~5 min |
4 | 二甲苯Ⅲ | 2~5 min |
5 | 無水乙醇I | 1min |
6 | 無水乙醇Ⅱ | 1min |
7 | 95%乙醇I | 1min |
8 | 95%乙醇Ⅱ | 1min |
9 | 85%乙醇 | 1min |
10 | 80%乙醇 | 1min |
11 | 70%乙醇 | 1min |
12 | 自來水水洗3次,將水控凈 |
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13 | 蘇木精? | 5min |
14 | 自來水水洗3次 |
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15 | l%鹽酸乙醇分化 | 3~5s |
16 | 自來水水洗3次 |
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17 | O.5%氨水返藍(lán) |
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18 | 自來水水洗3次 |
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19 | 1%伊紅水溶液 | 1min |
20 | 自來水水洗3次 |
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21 | 70%乙醇 | 1min |
22 | 80%乙醇 | 1min |
23 | 95%乙醇I | 1min |
24 | 95%乙醇Ⅱ | 1min |
25 | 無水乙醇I | 1min |
26 | 無水乙醇Ⅱ | 1min |
27 | 無水乙醇Ⅲ | 1min |
28 | 二甲苯I | 1min |
29 | 二甲苯Ⅱ | 1min |
30 | 二甲苯Ⅲ | 擱置至封片 |
2.注意事項(xiàng)
(1)石蠟切片放入恒溫箱中烤片,溫度不可過低或過高,以75℃為宜,否則在染色過程中容易發(fā)生脫片。
(2)組織切片脫蠟要經(jīng)二甲苯三次才能徹底。切片從恒溫箱取出后應(yīng)趁熱浸入二甲苯以利于徹底脫蠟。使用一段時(shí)間后,第一缸二甲苯融的蠟較多應(yīng)倒棄,其后的二甲苯依次前移,最后一缸換新鮮的二甲苯。
(3)切片經(jīng)70%乙醇后入蘇木精染液前,必須自來水水洗3次,最后1次最好用蒸餾水水洗并控干。這樣可以保證Harris蘇木精染色能力持久,而不會(huì)因?yàn)榈蜐舛纫掖嫉幕旌隙^早的喪失染色能力。
(4)Harris蘇木精染液配制的好壞直接影響切片染色質(zhì)量。好的蘇木精染液500 ml正常染色能力為2500張左右。為保證染色質(zhì)量應(yīng)及時(shí)更換染液。
(5)蘇木精染液要經(jīng)常過濾以保證染色清潔而不在切片上有染色渣的出現(xiàn)。
(6)鹽酸乙醇分化液配制參見本書第十二章。分化時(shí)間可根據(jù)分化液的新舊適當(dāng)調(diào)整,新的分化液時(shí)間短些。分化的目的就是讓該染上要清晰地染上,而不該著色的一定要分化掉。
(7)氨水返藍(lán)液濃度不可過高,返藍(lán)時(shí)間不可過高,不要過長(zhǎng),否則會(huì)發(fā)生脫片現(xiàn)象。
(8)1%伊紅水溶液是理想的胞漿染液。要選擇好水溶性的伊紅染料使胞質(zhì)鮮艷一些,切片不但漂亮且利于觀片。
(9)切片染色后的脫水要充分,每道乙醇脫水的時(shí)間不要過短,尤其是三道無水乙醇更為如此。無水乙醇要勤更換。
(10)切片經(jīng)最后一次無水乙醇后盡快地放人二甲苯中。在夏季室內(nèi)濕度較大的環(huán)境中更是如此。如切片在濕度大的空氣中停留時(shí)間過長(zhǎng)就會(huì)在封片時(shí)產(chǎn)生霧氣, 而不能現(xiàn)片。其原因是無水乙醇吸收了空氣中的水汽,在二甲苯中難以分離析出,當(dāng)用中性樹膠封片后,二甲苯揮發(fā),而水汽留在膠中產(chǎn)生霧氣。
(11)封片所使蓋玻片需大小合適、清潔。樹膠用量視蓋玻片大小而定,要求不發(fā)生溢膠或缺如。
(12)不提倡切片經(jīng)無水乙醇,然后干燥,直接用中性樹膠封固。這樣會(huì)產(chǎn)生人為的細(xì)小黑點(diǎn),與細(xì)胞核相似。
(13)封片要在通風(fēng)廚中進(jìn)行,防止二甲苯污染工作間,危害技師的身體。
二、自動(dòng)染色機(jī)
自動(dòng)染色機(jī)是近幾年才引進(jìn)的病理自動(dòng)儀器,在病理制片過程中發(fā)揮著重要的作用,它可以連續(xù)進(jìn)行染色,自動(dòng)記憶,染色效果好,質(zhì)量控制到位。起到了手工無法比擬的作用。
1.液體設(shè)置:由于機(jī)器為電腦控制,染液順序及液體的設(shè)置根據(jù)染色機(jī)所設(shè)置的染色缸多少來調(diào)配。染色機(jī)基本模擬手工方法,利用機(jī)器手來完成操作程序見表8.2。
二甲苯 | 二甲苯 | 二甲苯 | 無水乙醇 | 無水乙醇 | 95%乙醇 | 85%乙醇 | 水 | 水 | 水 | 水 | 水 | 烤箱65℃ |
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停機(jī)報(bào)警取籃處 | 二甲苯 | 二甲苯 | 二甲苯 | 無水乙醇 | 無水乙醇 | 95%乙醇 | 85%乙醇 | 伊紅 | 1% 氨水 | 1% 鹽酸乙醇 | 蘇木精 | 裝機(jī) |
2.注意事項(xiàng)
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(1)工作前先檢查染液及試劑,并開啟電源。
(2)開啟進(jìn)水開關(guān)。
(3)調(diào)試好所需的染色程序,根據(jù)蘇木精一伊紅的新舊來調(diào)整時(shí)間。
(4)將切片染色籃放人染色機(jī)后按提示鍵即可按程序進(jìn)行染色。
(5)聽到提示音響后,取出已染好的切片染色籃進(jìn)行封片。
(6)工作完成后,關(guān)閉電源,關(guān)掉水源,并蓋好染色缸。
(7)染色機(jī)配制的無水乙醇及95%乙醇的程序比手工程序少,但不影響染色效果,因機(jī)械手在提升時(shí)有抖動(dòng)作用,帶的液體很少。
(8)定期取出活性碳過濾網(wǎng)晾曬保證使用。
(9)工作結(jié)束后一定要取出鹽酸乙醇,以免長(zhǎng)期放在機(jī)器內(nèi),腐蝕機(jī)器。